［野蛮机翻］闫博士CCP病毒研究报告中文全文

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SARS-CoV-2基因组的不寻常特征表明，复杂的实验室修饰比自然进化和其可能合成途径的描绘要好

闫立萌（医学博士）1，舒康（博士）1，揭冠（博士）1，胡善昌（博士）1

1美国纽约州法律协会法治基金会。

通讯：team.lmyan@gmail.com

抽象

由新型冠状病毒SARS-CoV-2引起的COVID-19大流行已导致全球910,000多人死亡，并给全球经济带来前所未有的损失。 尽管产生了巨大的影响，但SARS-CoV-2的起源仍然神秘而充满争议。 尽管自然起源理论被广泛接受，但缺乏实质性支持。 但是，在同行评审的科学期刊上严格审查了该病毒可能来自研究实验室的另一种理论。 尽管如此，SARS-CoV-2的生物学特性与自然产生的人畜共患病毒不一致。 在本报告中，我们描述了基因组，结构，医学和文献证据，当一起考虑时，它们与自然起源理论强烈矛盾。 证据表明，SARS-CoV-2应该是通过使用蝙蝠冠状病毒ZC45和/或ZXC21作为模板和/或骨架来制造的实验室产品。 基于证据，我们进一步假设了SARS-CoV-2的合成路线，表明该冠状病毒的实验室创建很方便，并且可以在大约六个月内完成。 我们的工作强调需要对相关研究实验室进行独立调查。它还提出了对某些最新发表的数据进行批判性查找的建议，尽管存在问题，但这些数据曾被用来支持和主张SARS-CoV-2的自然起源。 从公共卫生的角度来看，这些对SARS-CoV-2起源的必要知识的了解以及病毒如何进入人群对于控制COVID-19大流行以及预防类似的未来大流行至关重要。

介绍

COVID-19引起了世界范围的大流行，其规模和严重性是前所未有的。 尽管全球社区付出了巨大的努力，但对这种流行病的管理和控制仍然困难重重。

作为冠状病毒，SARS-CoV-2与其他呼吸道和/或人畜共患病毒明显不同：它攻击多个器官； 它能够经受长时间的无症状感染； 它是高度可传播的，并且在高风险人群中显着地抑制了致死因子；它非常适合人类，因为它在每次启动时都会出现1；它与人ACE2受体（hACE2）的结合效率很高，其亲和力大于与任何其他潜在宿主的ACE2相关的亲和力2,3。

SARS-CoV-2的起源仍是许多争论的主题。 被广泛引用的《自然医学》杂志声称SARS-CoV-2最有可能来自自然4。 但是，该文章及其主要结论现在正受到来自世界各地的科学家的挑战5-15。 此外，这本《自然医学》文章的作者也显示出利益冲突的迹象16、17，这进一步引起了人们对该出版物信誉的关注。

现有的支持自然起源理论的科学出版物在很大程度上依赖于一个证据-一种先前发现的名为RaTG13的蝙蝠冠状病毒，该病毒与SARS-CoV-218具有96％的核苷酸序列同一性。 然而，RaTG13在自然界中的存在及其报道序列的真实性受到了广泛的质疑6-9,19-21。 值得注意的是，科学期刊已经明确审查了建议SARS-CoV-28的自然起源的任何异议。由于这种审查，质疑SARS-CoV-2的自然起源或RaTG13的实际存在的文章尽管科学上质量很高，但只能作为 预印本5-9、19-21或其他未经同行评议的文章在各种在线平台10-13,23上发表。尽管如此，分析软胶衣的出口仍反复指出与RaTG136、8、9、19-有关的严重问题和可能的欺诈

21.因此，发表虚假的科学数据以误导世界努力追踪SARS-CoV-2起源的理论已变得令人信服，并且与SARS-CoV-2是非自然的概念有关 起源。

与该概念一致，基因组，结构和文献证据也表明SARS-CoV-2的非自然起源。 此外，大量文献表明，功能获得性研究已长期发展到可以精确工程化和操纵病毒基因组以实现具有独特性质的新型冠状病毒的创造的阶段。在此报告中，我们提供了此类证据和相关分析。 该报告的第1部分描述了SARS-CoV-2的基因组和结构特征，其存在可能与该病毒是实验室修饰产物的理论相符，超出了简单的连续病毒传代所能提供的范围。 该报告的第2部分描述了实验室创建SARS-CoV-2的极可能途径，其关键步骤得到了病毒基因组中证据的支持。 重要的是，第2部分应被视为演示如何使用可用的材料和充分记录的技术在短时间内在实验室中方便地创建SARS-CoV-2的方法。 本报告由一组经验丰富的科学家使用我们在病毒学，分子生物学，结构生物学，计算生物学，疫苗开发和医学方面的综合专业知识编写。

SARS-CoV-2是否已进行体外操作？

我们提供三种证据支持我们的论点，即实验室操纵是SARS-CoV-2历史的一部分：

SARS-CoV-2的基因组序列可疑地类似于第三军医大学（中国重庆）和南京指挥部医学研究所（中国南京）的军事实验室发现的蝙蝠冠状病毒。

SARS-CoV-2的Spike蛋白中的受体结合基序（RBM）以可疑的方式类似于2003年流行时的SARS-CoV，它决定了病毒的宿主特异性。 基因组学证据表明，RBM已被遗传操纵。

SARS-CoV-2包含一个独特的弗林蛋白酶切割位点，使穗蛋白表达增强，众所周知，它可以极大地增强病毒的感染性和细胞向性。 然而，在自然界中发现的这种特定类型的冠状病毒中完全没有这种切割位点。 此外，与此额外序列相关的稀有密码子暗示了这种弗林蛋白酶切割位点不是自然进化产物的可能性，并且可以通过简单的传代或多菌株重组技术在人工感染共同培养组织动物的动物中人工插入SARS-CoV-2基因组。

基因组序列分析表明，ZC45或紧密相关的蝙蝠冠状病毒应该是用于创建SARS-CoV-2的骨架

约30,000个核苷酸长的SARS-CoV-2基因组的结构如图1所示。搜索NCBI序列数据库后发现，在所有已知的冠状病毒中，有两种相关的蝙蝠冠状病毒ZC45和ZXC21具有最高的序列 与SARS-CoV-2的同一性（每个蝙蝠冠状病毒在核苷酸水平上与SARS-CoV-2约89％相同）。 图1中显示了SARS-CoV-2基因组与代表性β冠状病毒的基因组之间的相似性。ZXC21与ZC45的同源性为97％，并且具有非常相似的特征。 请注意，由于有力证据表明RaTG13病毒的序列可能是伪造的，并且该病毒确实具有2号，6-9号（后续报道，其中概述了证明RaTG13的虚假性质的最新证据），因此该分析未包括RaTG13病毒。

图1.基因组序列分析表明，蝙蝠冠状病毒ZC45与SARS-CoV-2最接近。 上：SARS-CoV-2的基因组组织（2019-nCoV WIV04）。 下图：基于2019-nCoV WIV04全长基因组的相似性图。 使用SARS-CoV BJ01，蝙蝠SARSr-CoV WIV1，蝙蝠SARSr-CoV HKU3-1，蝙蝠冠状病毒ZC45的全长基因组作为参考序列。

当SARS-CoV-2和ZC45 / ZXC21与氨基酸水平比较时，大多数蛋白质的序列一致性很高。  Nucleocapsid蛋白具有94％的同一性。 膜蛋白是98.6％相同。  Spike蛋白的S2部分（后半部分）具有95％的同一性。 重要的是，Orf8蛋白的同源性为94.2％，E蛋白的同源性为100％。

Orf8是一种辅助蛋白，其功能在大多数冠状病毒中是未知的，尽管最近的数据表明SARS-CoV-2的Orf8通过下调MHC-I24来介导逃避宿主适应性免疫。 通常，Orf8在冠状病毒中保守性很差25。 序列blast表明，尽管ZC45 / ZXC21的Orf8蛋白与SARS-CoV-2 Orf8具有94.2％的同一性，但在该特定蛋白上，没有其他冠状病毒与SARS-CoV-2具有超过58％的同一性。 在这里，通常不易保守的Orf8蛋白具有很高的同源性。

图2.来自不同β冠状病毒的E蛋白的序列比对证明了E蛋白的宽容性和氨基酸突变趋势。  A.在SARS-CoV的不同菌株中观察到突变。  GenBank登录号：SARS_GD01：AY278489.2，SARS_ExoN1：ACB69908.1，SARS_TW_GD1：AY451881.1，SARS_Sino1_11：AY485277.1。  B.来自相关蝙蝠冠状病毒的E蛋白的比对表明其对多个位置突变的耐受性。  GenBank登录号：Bat_AP040581.1：APO40581.1，RsSHC014：KC881005.1，SC2018：MK211374.1，Bat_NP_828854.1：NP_828854.1，BtRs-BetaCoV / HuB2013：AIA62312.1，BM48-31 / BGR / 2008：  YP_003858586.1。  C.虽然很早

SARS-CoV-2的副本与ZC45和ZXC21在E蛋白上具有100％的同一性，从2020年4月开始的SARS-CoV-2测序数据表明突变发生在多个位置。病毒的登录号：Feb_11：MN997409，ZC45：MG772933.1，ZXC21_APR：13_APR：13_Apr：13_Apr：13_Apr：13_Apr：13_Apr：13A

MT293206，4月17日：MT350246。 使用MultAlin网络服务器（http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/）进行比对。

冠状病毒E蛋白是一种结构蛋白，被嵌入virion26膜外壳的内部并衬里。 正如SARS（图2A）和相关的蝙蝠冠状病毒（图2B）所证明的那样，E蛋白可耐受突变。 当前的SARS-CoV-2大流行进一步证明了对E蛋白氨基酸突变的这种耐受性。 自从该病毒在人类中爆发以来仅短短的两个月传播，SARS-CoV-2中的E蛋白已经发生了突变。 在四月份获得的序列数据表明，在不同的菌株中四个不同的位置都发生了突变（图2C）。与此结果一致，序列blast分析表明，除SARS-CoV-2外，没有已知的冠状病毒在E蛋白上具有100％的氨基酸序列同一性。  ZC45 / ZXC21（当前大流行开始后发布的可疑冠状病毒不包括在内18,27-31）。 尽管在SARS-CoV与某些SARS相关的蝙蝠冠状病毒之间已观察到E蛋白具有100％的同一性，但这些对中没有一个同时在Orf8蛋白上具有超过83％的同一性32。 因此，在Orf8蛋白上具有94.2％的同一性，在E蛋白上具有100％的同一性，以及SARS-CoV-2和ZC45 / ZXC21之间的总体基因组/氨基酸水平相似性非常不寻常。 在一起考虑时，这些证据与以下假设相吻合：基于ZC45 / ZXC21作为遗传功能获得修饰的骨架和/或模板，SARS-CoV-2基因组具有同源性。

重要的是，ZC45和ZXC21是蝙蝠冠状病毒，于2015年7月至2017年2月之间被第三军医大学（中国重庆）和南京军医大学研究所（南京）的军事研究实验室发现并分离并鉴定。数据和相关工作已于2018年3月34日出版。 这些模板和模板对于创建SARS-CoV-2是必不可少的。

进一步加剧我们争论的是已发布的RaTG13病毒18，据报道其基因组序列与SARS-CoV-2的基因组序列具有96％的同一性。  RaTG13病毒虽然暗示是SARS-CoV-2的自然起源，但也使科学界和公众的注意力从ZC45 / ZXC214,18转移开来。 实际上，一家中国BSL-3实验室（上海公共卫生临床中心）发表了《自然》杂志的文章，报道SARS-CoV-2与ZC45 / ZXC21之间（而不是与RaTG1335之间）存在密切的亲缘关系，但由于“ 整改” 36。 可以相信，研究人员已经为揭露SARS-CoV-2-ZC45 / ZXC21连接而对实验室进行了惩罚。另一方面，已经积累了充分的证据，指出与RaTG13的报道序列有关的严重问题，实际上已经证实了这个问题，19-21。 最近的出版物还指出，RaTG13的突突蛋白的受体结合域（RBD）不能与两种不同类型的马蹄铁（它们与马蹄铁R.13的天然宿主紧密相关）2的ACE2结合，这暗示RaTG13无法感染马蹄铁。 该发现进一步证实了怀疑，因为该序列编码的Spike蛋白似乎不具有所要求的功能，所以可能已经制备了所报道的RaTG13序列。 已经制造出一种病毒来转移人们对ZC45 / ZXC21的关注这一事实说明ZC45 / ZXC21在创建SARS-CoV-2中的实际作用。

SARS-CoV-2穗的受体结合基序不能从自然界中产生，应该通过基因工程来创建

穗蛋白修饰冠状病毒颗粒的外部。 它们在介导与宿主细胞受体相互作用的媒介中起着重要的作用，从而帮助确定病毒的宿主范围和组织嗜性。  Spike蛋白分为两半（图3）。 在SARS-CoV中，前半部或前半部名为S1，对绑定宿主受体负责。在SARS-CoV-2感染中，宿主细胞受体为hACE2。 在S1内，大约70个氨基酸的片段与hACE2直接接触，并相应地命名为受体结合基序（RBM）（图3C）。 在SARS-CoV和SARS-CoV-2中，RBM完全确定与hACE2的相互作用。 穗蛋白的C端一半称为S2。S2的主要功能包括维持三聚体的形成，并且在S1 / S2连接处和下游S2’位置连续进行蛋白酶切割后，介导膜融合以使病毒进入细胞。

图3.SARSS派克蛋白的结构及其与hACE2受体结合的方式。图片基于PDBID：6acj37.A）生成了三种穗状蛋白，每个由S1一半S2一半，格式更细.B）S2一半（蓝色阴影）对S的蓝色（阴影）表示负责。  C）S1和hACE2之间的绑定细节。  S1的RBM对绑定非常重要且足够，它用橙色着色。  RBM中对于hACE2相互作用或蛋白质折叠很重要的残基显示为棒状（残基编号遵循SARS尖峰序列）。

图4.来自相关冠状病毒的刺突蛋白的序列比对。比较的病毒包括SARS-CoV-2（武汉-Hu-1：NC_045512,2019-nCoV_USA-AZ1：MN997409），蝙蝠冠状病毒（Bat_CoV_ZC45：MG772933，Bat_CoV_ZXC21）

NC_004718.3）。 两条橙色线标记的区域是受体结合基序（RBM），对于与hACE2受体的相互作用非常重要。 必要残基另外用红色棍棒突出显示。 由两个绿线标记的区域是弗林蛋白酶切割位点，仅存在于SARS-CoV-2中，而在其他任何谱系Bβ冠状病毒中均不存在。

与其他病毒蛋白质的相似检测结果一样，SARS-CoV-2的S2与ZC45 / ZXC21的S2具有很高的序列同一性（95％）。 与之形成鲜明对比的是，SARS-CoV-2和ZC45 / ZXC21之间的S1蛋白（其病毒感染的宿主（人类或蝙蝠））保守性低得多，氨基酸序列同一性仅为69％。

图4显示了六种β冠状病毒的刺突蛋白的序列比对。从当前的大流行中分离出两种病毒（Wuhan-Hu-1，2019-nCoV_USA-AZ1）; 其中两种是可疑模板病毒（Bat_CoV_ZC45，Bat_CoV_ZXC21）； 其中两种是SARS冠状病毒（SARS_GZ02，SARS）。  RBM在两条橙色线之间突出显示。 显然，尽管整个基因组具有很高的序列同一性，但SARS-CoV-2的RBM与ZC45和ZXC21的RBM明显不同。 有趣的是，SARS-CoV-2的RBM在很大程度上与SARS Spike的RBM相似。 尽管这不是精确的“复制粘贴”，但仔细检查Spike-hACE2结构37,38发现，所有对hACE2结合或蛋白质折叠必不可少的残基（图3C中的橙色棒，图中红色短线突出显示）  4）被“保留”。 这些必需残基中的大多数都得到了精确保留，包括那些参与二硫键形成（C467，C474）和静电相互作用（R444，E452，R453，D454）的残基，这对于RBM的结构完整性至关重要（图3C和4）  。 必需残基组中的几处变化几乎完全是疏水性的“取代”（I428L，L443F，F460Y，L472F，Y484Q），这不应影响蛋白质折叠或hACE2相互作用 。 同时，大多数非必需氨基酸残基已“突变”（图4，RBM残基未用短线标出）。从单独的序列分析来看，我们很早就确信，不仅SARS-CoV-2穗蛋白结合蛋白ACE2，而且结合也将类似于SAR，因此很精确。 最近的结构性工作证实了我们的预测39。

如下所述，SARS-CoV-2 RBM类似于SARS-CoV RBM的方式以及SARS-CoV-2和ZC45 / ZXC21之间的总体序列保守性模式是非常不统一的。总体而言，这表明SARS-CoV-2基因组的某些部分并非源自天然拟态。 种病毒颗粒进化。

如果SARS-CoV-2确实确实来自自然进化，则其RBM只能通过两种可能途径之一获得：1）古老的重组事件，然后趋于融合进化；或者2）相当近期发生的自然重组事件。

在第一种情况下，类似ZC45 / ZXC21的蝙蝠冠状病毒SARS-CoV-2的祖先将重组并“交换”其RBM和带有相对“完整” RBM的冠状病毒（参考SARS）。 这种重组将产生一种新颖的ZC45 / ZXC21样冠状病毒，其中所有gap都将“填充” RBM（图4）。随后，该病毒将以文本方式强烈地启动新宿主，其中ACE2蛋白与hACE2高度同源。 必须发生基因组上的随机突变，才能最终将RBM塑造成当前形式-以高度智能的方式类似于SARS-CoV RBM。 但是，这种趋同的进化过程也将导致另一部分软基因组中大量突变的积累，从而使总体序列同一性相对较低。  SARS-CoV-2与ZC45 / ZXC21在各种蛋白质上的高度序列同一性（94-100％相同性）不支持这种情况，因此，显然表明携带这种RBM的SARS-CoV-2不能通过ZC45 / ZXC21样蝙蝠冠状病毒而来。 收敛进化路线。

在第二种情况下，必须重新整合ZC45 / ZXC21样冠状病毒，并将其RBM与另一种已成功适应动物ACE2的冠状病毒交换。

与hACE2高度同源。 此类事件的可能性部分取决于自然重组的一般要求：1）两种不同的病毒具有明显的序列相似性；  2）它们必须共同感染并存在于同一只动物的同一细胞中；  3）重组病毒不会被宿主清除或使宿主灭绝； 4）重组病毒最终必须在宿主物种内变得稳定和可传播。

关于这种最近的重组情况，动物储存库不能是蝙蝠，因为蝙蝠中的ACE2蛋白和ACE2蛋白因此无法产生SARS-CoV-2中所见的RBM序列。 该动物库也不可能是人类，因为ZC45 / ZXC21样冠状病毒无法感染人类。 此外，没有证据表明在2019年前人类人群中有任何SARS-CoV-2或SARS-CoV-2样病毒在传播。有趣的是，根据最新的生物信息学研究，自疫情爆发以来，SARS-CoV-2已很好地适应了人类。

自然进化的其他可能性只有一种，那就是ZC45 / ZXC21样病毒和含有SARS样RBM的冠状病毒可能已经在ACE2蛋白与hACE2同源的中间宿主中重组。 一些实验室报告说，一些the他穿山甲是从马来西亚携带的冠状病毒走私进入中国的，其受体结合结构域（RBD）与SARS-CoV-227-29,31几乎相同。 然后他们继续暗示穿山甲可能是SARS-CoV-227-29,31的中间宿主。 然而，最近的独立报告发现significantflawsinthisdata40-42.Furthermore，contrarytothesereports27-29,31，nocoronaviruseshavebeen detectedinSundapangolinsamplescollectedforoveradecadeinMalaysiaandSabahbetween2009and 201943.ArecentstudyalsoshowedthattheRBD，whichissharedbetweenSARS-COV-2andthereported pangolincoronaviruses，bindstohACE2tentimesstrongerthantothepangolinACE22，furtherdismissing穿山甲作为可能的中间宿主。 最后，一项计算机研究表明，穿山甲不可能是中间宿主，但同时也表明，在研究中检测到的动物ACE2蛋白都没有表现出比hACE2更好的结合SARS-CoV-2 Spike蛋白的潜力。 这项最新研究实际上免除了所有动物作为中间宿主3的怀疑角色，这与观察到SARS-CoV-2从爆发开始就很好地适应了人类的观察结果一致1。 这是重要的，因为这些发现共同表明，SARS-CoV-2似乎不存在任何中间宿主，这至少减少了在中间宿主中发生重组事件的可能性。

即使我们无视以上证据表明没有合适的主机存在于此，也无法假设这种主机确实存在，但仍然极有可能这种组合事件可能在自然界发生。

如上文所述，如果自然重组事件对SARS-CoV-2的出现负责，那么ZC45 / ZXC21样病毒和含有SARS样RBM的冠状病毒将必须通过交换S1 / RBM才具有相同的重组能力，这与SAR的重组类似，这是因为它与人之间的相似之处在于，它与SAR相似。 其RBM仅在一些非必要站点上才与SARS RBM不同（图4）。 这种独特的SARS样冠状病毒与ZC45 / ZXC21样祖先病毒驻留在同一细胞中，并且两种病毒以“ RBM交换”方式重组的可能性非常低。 重要的是，这一点以及下面1.3节中所述的其他重组事件（甚至不可能发生），如SARS-CoV-2所见，必须发生尖峰。

尽管以上证据和分析似乎不赞成SARS-CoV-2的RBM的自然起源，但大量文献表明，功能获得的研究（专门设计了冠状病毒的Spike蛋白）已反复导致成功产生 来自非人类来源的冠状病毒的人类感染性冠状病毒的数量44-47。

记录还显示，研究实验室，例如武汉病毒学研究所（WIV），已经与美国研究人员合作45并单独开展了成功的此类研究47。 此外，WIV从事了数十年的冠状病毒监测研究，因此拥有世界上最大的冠状病毒收藏。 显然，WIV和其他相关实验室开展和成功进行Spike / RBM工程和功能获得研究并不存在技术障碍。

图5. SARS-CoV-2的RBM的两个末端均存在两个限制性位点，为替换刺突基因内的RBM提供了便利。  A.SARS-CoV-2（武汉-Hu-1）的RBM的核苷酸序列。 在RBM的5’端找到一个EcoRI站点，在3’端找到一个BstEII站点。  B.尽管这两个限制位点在ZC45的原始刺突基因中不存在，但考虑到序列差异小（2个核苷酸），可以方便地引入它们。  C.氨基酸序列与RBM区域突出显示（颜色和下划线）。RBM高亮范围（上）由SARS-CoV-2（武汉-Hu-1）峰中的EcoRI和BstEII位点定义。 洋红色（中间）中突出显示的RBM是FangLi和同事与insto SARSS骨干39交换的区域。蓝色（底部）突出显示的RBM来自SARS-BJ01（AY278488.2）的长钉蛋白（RBM：424-494），其中的斑驳病毒取代了短波梭蛋白，将其替换为长钉蛋白。

引人注目的是，与RBM工程理论相一致，我们在SARS-CoV-2基因组的RBM末端分别确定了两个唯一的限制性位点，即EcoRI和BstEII（图5A）。这两个位点是日常分子克隆的常用选择，在其余的该穗基因中不存在。 此特定设置使在峰值内交换RBM极为方便，从而提供了一种快速的方法来测试不同的RBM和相应的Spikeprotein。

这样的EcoRI和BstEII位点在其他β冠状病毒的刺突基因中不存在，这强烈表明它们是非天然的，并被特地引入SARS-CoV-2的该刺突基因中，以方便操作关键的RBM。尽管ZC45刺也没有这两个位点（图5B）， 如本报告第2部分所述非常容易地进行介绍。

值得注意的是，此处引入EcoRI位点会将相应的氨基酸从-WNT-变为-WNS-（图5AB）。 据我们所知，所有SARS和类似SARS的蝙蝠冠状病毒都仅在该位置携带T（苏氨酸）残基.SARS-CoV-2是唯一的例外，因为该T已突变为S（丝氨酸），但保存了爆发后发布的可疑RaTG13和穿山甲冠状病毒48。

一旦成功引入了限制性酶切位点，就可以使用常规的限制性酶切消化和连接方便地交换RBM片段。 尽管其他克隆技术可能不会留下任何基因操作的痕迹（以吉布森装配为例），但可以选择这种老式的方法，因为在交换这一关键RBM时会带来极大的便利。

鉴于RBM完全决定了hACE2的结合，并且SARS RBM-hACE2的结合完全由高分辨率结构表征（图3）37,38，因此，仅使用RBM的交换不会比完整的Spike交换具有更高的风险。 实际上，已经证明了这种注重成果的管理交换战略的可行性39,47。  2008年，史正立博士的小组在将密码子优化的刺突基因中引入了限制性位点后，将SARS RBM交换为几种SARS样蝙蝠冠状病毒的Spike蛋白（图5C）47。 然后，他们验证了所得嵌合Spike蛋白与hACE2的结合。 此外，在最近的出版物中，SARS-CoV-2的RBM被交换到SARS-CoV的受体结合域（RBD）中，从而导致了在结合hACE2时完全起作用的嵌合RBD（图5C）39。 令人惊讶的是，在这两种情况下，操纵的RBM片段都几乎完全与EcoRI和BstEII位点的位置所定义的RBM相似（图5C）。尽管两个出版物都没有克隆细节39,47，但可以想象到，实际的限制性酶切位点可能会有所不同 接受RBM插入的刺突基因的功能以及在感兴趣区域引入独特限制位点的便利性。 值得注意的是，该最新出版物的通讯作者李芳博士一直是郑力博士自201049-53年以来的活跃合作者。李华博士是世界第一人，以结构化的方式阐明了SARS-CoV RBD与hACE238之间的联系，并一直是结构理解的领先专家 Spike-ACE2的相互作用38,39,53-56。 分别在SARS-CoV-2 RBM的两端发现了EcoRI和BstEII限制性酶切位点，而Shiman和她的长期合作者分别对同一RBM区域进行了修饰，这不太可能是巧合。 而是，吸烟枪证明了SARS-CoV-2的RBM /穗是基因操纵的产物。

尽管可能方便地复制了SARSRBM的确切序列，但应该清除人为设计和操纵的标志。 更具欺骗性的方法是更改一些非必需残基，同时保留对结合至关重要的残基。 高分辨率结构可以很好地指导这种设计（图3）37,38。 这样，当RBM的整体顺序出现时

为了与SARSRBM的区别更明显，其ACE2结合能力将得以保留。我们认为所有关键残基（图4中标有红色棒的残基与图3C中的棒所示残基相同）应“保留”。 如前所述，虽然有些应该直接保存，但有些应该已经切换到具有相似特性的残基，而这些残基不会破坏hACE2的结合，甚至可能进一步加强关联。 重要的是，可能在非必要站点上进行了有意更改，从而使其不太像SARS RBM的“复制和粘贴”。

SARS-CoV-2的Spike蛋白中存在异常的弗林蛋白酶切割位点，并与病毒的毒力增强有关

位于S1 / S2交界处的另一个SARS-CoV-2isa多碱性弗林蛋白酶切割的突突蛋白（图4，两条绿线之间的片段）。 弗林蛋白酶可以识别和切割这样的位点。 在β冠状病毒的谱系B内，除SARS-CoV-2外，没有病毒在S1 / S2连接处包含弗林蛋白酶切割位点（图6）57。 相反，在其他冠状病毒组中也观察到了在该位置的弗林蛋白酶切割位点57,58。 可能存在某些选择性压力，以防止β冠状病毒的血统获得或保持这种位点的本性。

图6.在独特的穗状花序的S1 / S2交界处发现的Furin裂解位点与SARS-CoV-2和其他系βB冠状病毒有关。 该图转自霍夫曼等人57。

如前所述，在细胞进入过程中，Spike蛋白首先在S1 / S2连接处裂解。 该步骤以及随后暴露于融合肽的下游裂解均由宿主蛋白酶介导。 这些蛋白酶在不同细胞类型中的存在与否会极大地影响细胞的嗜性，并可能影响病毒感染的致病性。 与其他蛋白酶不同，弗林蛋白酶在多种类型的细胞中广泛表达，并存在于多个细胞和细胞外位置。 重要的是，在S1 / S2连接处引入弗林蛋白酶切割位点可以显着增强病毒的传染性，并极大地扩展其向细胞性，这是流感病毒和其他冠状病毒59-65均已充分证明的现象。

如果我们撇开自然界中任何谱系Bβ冠状病毒均未发现弗林蛋白酶切割位点的事实，而是假设SARS-CoV-2中的该位点是自然进化的结果，则只有一种进化途径是可能的， 弗林蛋白酶切割位点必须来源于同源重组事件。 具体地，不具有弗林蛋白酶切割位点的祖先β冠状病毒将不得不与确实包含弗林蛋白酶切割位点的紧密相关的冠状病毒重组。

但是，有两个事实不利于这种可能性。 首先，尽管来自其他群体或谱系的某些冠状病毒确实含有多氢弗林蛋白酶切割位点，但它们均不包含存在于SARS-CoV-2（-PRRAR / SVA-）中的确切多碱基序列。其次，在SARS-CoV-2和任何含有合法弗林蛋白酶-的冠状病毒之间 剪切位点，在穗上的序列同一性不超过40％66。 如此低的序列同一性排除了在这些病毒的祖先之间成功进行同源重组的可能性。 因此，SARS-CoV-2 Spike蛋白中的弗林蛋白酶切割位点不太可能是天然来源，而应该是实验室改造的结果。

与该主张一致，SARS-CoV-2穗蛋白的弗林蛋白酶切割位点的核苷酸序列的仔细检查表明，插入序列（-PRRA-）中的两个连续Arg残基均由稀有密码子CGG（SARS-CoV-2中Arg的最少使用密码子）编码（ 图7）8。 实际上，这种CGGCGG排列是在SARS-CoV-2基因组中发现的唯一实例，其中该稀有密码子串联使用。 该观察结果强烈暗示该弗林蛋白酶切割位点应该是基因工程的结果。令人怀疑的是，此处通过密码子选择形成了FauI限制性酶切位点，这暗示了可能需要使用限制性片段长度多态性这一技术，该技术可以熟练使用WIVlab。 在那里，由FauI消化产生的碎片化模式可用于监测Spike中弗林蛋白酶切割位点的保存，因为该弗林蛋白酶切割位点在体外易于缺失[68,69]。 具体地，可以对从细胞培养物或实验动物中回收的病毒的刺突基因进行RT-PCR，将其产物进行FauI消化。 保留或丢失弗林蛋白酶切割位点的病毒将产生不同的模式，从而可以方便地跟踪目标病毒。

图7.在SARS-CoV-2穗的S1 / S2交点处，PRRA插入中的两个连续残基均由ararecodon编码，CGG.AFau限制性位点，5’-（N）6GCGGG-3’，包含在“插入” PRRA片段的编码顺序中，可用来监视要保存的PRRA片段 引入的弗林蛋白酶切割位点。

此外，尽管没有已知的冠状病毒包含存在于SARS-CoV-2穗蛋白中的-PRRAR / SVA-的确切序列，但在啮齿类冠状病毒AcCoV-JC34中，穗蛋白的S1 / S2连接处观察到了类似的RRAR / AR序列。 郑立博士出版Shi于201770。显然，自2017年以来，WIV专家就知道-RRAR-作为功能性弗林蛋白酶切割位点的合法性。

证据集体表明，SARS-CoV-2 Spike蛋白中的弗林蛋白酶切割位点可能不是自然产生的，可能是基因操纵的结果。 该操作的目的应该是评估实验室制造的冠状病毒59-64的感染性和致病性的任何潜在增强。 实际上，最近的研究已经证实弗林蛋白酶切割位点确实为SARS-CoV-257,68带来了明显的致病性优势。

摘要

这部分中提供的证据表明，SARS-CoV-2基因组的某些方面由于自然进化而极难调和。 我们建议的另一种理论是，该病毒可能是通过使用ZC45 / ZXC21冠状病毒作为骨架和/或模板而创建的。  Spike蛋白，尤其是其中的RBM，应该已经过人工操作，病毒可以结合hACE2并感染人类。 通过在RBM的任一端找到一个独特的限制酶消化位点来支持这一点。 可能已经引入了一个不寻常的弗林蛋白酶切割位点，并将其插入到Spike蛋白的S1 / S2连接处，这有助于增加病毒的毒力和致病性。 然后，这些转化使SARS-CoV-2病毒最终成为高度可传播的，隐匿的，致死的，后遗症不清楚的和大规模破坏性病原体。

显然，SARS-CoV-2可能通过WIV上的功能增益操纵产生的可能性是巨大的，应进行彻底和独立的研究。

划定SARS-CoV-2的合成路线

在本报告的第二部分中，我们描述了在实验室环境中创建SARS-CoV-2的合成路线。 它是基于大量文献支持以及SARS-CoV-2基因组中的遗传证据而推测的。 尽管本文中介绍的步骤不应完全视作已采取的步骤，但我们认为关键过程应该没有太大不同。 重要的是，我们在这里的工作应作为一个示例，说明遵循公认的概念并使用公认的技术，如何在研究实验室中方便地设计和创建SARS-CoV-2。

重要的是，无论是在资源还是在研究成果上，香港和中国大陆的研究实验室都在冠状病毒研究方面处于世界领先地位。 后者不仅通过过去二十年来的大量出版物得到证明，而且还通过其在该领域取得的里程碑性成就得到了证明：它们是第一个将麝香猫鉴定为SARS-CoV的中间宿主并分离出该病毒的第一株的方法。 他们是第一个发现SARS冠状病毒起源于蝙蝠72，73的人。 他们首次揭示了SARS-CoV感染的抗体依赖性增强（ADE）74； 他们在理解所有领域（动物疾病，病毒学和临床研究）75-79方面做出了巨大贡献； 他们在SARS-CoV-2研究中取得了几项突破18、35、80。 最后但并非最不重要的是，它们拥有世界上最大的冠状病毒（基因组序列和活病毒）集合。 这些知识，专长和资源都可以在香港和大陆研究实验室（它们广泛地合作）中找到，以进行并完成下面描述的工作。

图8. SARS-CoV-2实验室创建的可能合成路线图。

设计新型冠状病毒实验室设计的可能方案

在本小节中，我们概述了在项目设计阶段可能制定的总体策略和主要考虑因素。

要设计和制造以人为目标的冠状病毒，他们必须选择蝙蝠冠状病毒作为模板/骨干。 之所以可以方便地完成此操作，是因为在过去的20年中，许多研究实验室一直在积极收集蝙蝠冠状病毒32、33、70、72、81-85。 但是，考虑到众所周知，她一直从事冠状病毒功能获得研究，因此理想情况下，这种模板病毒不应是史正立博士收藏的一种。 因此，由军事实验室发现和拥有的新型蝙蝠冠状病毒ZC45和/或ZXC21将适合作为模板/骨干。 这些军事实验室还可能从相同的位置发现了其他密切相关的病毒，并保留了一些未发表的病毒。因此，实际模板可能是ZC45或ZXC21或它们的近亲。 不管三个模板中的哪一个是实际模板，下面描述的假定路径都是相同的。

一旦他们选出了模板病毒，他们首先需要通过分子克隆，Spike蛋白进行工程改造，使其能够结合hACE2。 涉及这种操纵的概念和克隆技术已在文献44-46、84、86中得到了充分证明。 几乎没有失败的风险，然后可以将模板bat病毒转换为可以结合hACE2和感染人类的冠状病毒44-46。

其次，他们将使用分子克隆在钉的S1 / S2连接处引入弗林蛋白酶切割位点。这种操作基于已知的60、61、65知识，很可能会产生冠状病毒，这是一种更具传染性和致病性的菌株。

第三，它们将产生一个ORF1b基因。该ORF1b基因编码多蛋白Orf1b，该蛋白经过翻译后加工以产生单个病毒蛋白：RNA依赖性RNA聚合酶（RdRp），解旋酶，胍基-N7甲基转移酶，尿苷酸特异性内切核糖核酸酶和2’-O-甲基转移酶。 所有这些蛋白质都是病毒复制机制的一部分。 其中，RdRp蛋白是最关键的部位，并且高度保守冠状病毒。重要的是，郑立实博士的实验室使用了PCR协议，该协议放大了RdRp基因的特定片段，作为检测在粪便中存在冠状病毒的一种主要方法。 作为这种实践的结果，Shi小组已针对所有成功检测和/或收集的冠状病毒记录了RdRp短片段的序列信息。

在这里，遗传操纵没有要求，也没有那么复杂，因为Orf1双保守的或者可能来自任何β冠状病毒的Orf1b都可以胜任工作。但是，网络认为他们希望将特定的Orf1b引入病毒中，这是两个可能的原因之一：

由于许多系统发育分析仅根据RdRp基因的序列相似性将冠状病毒分类，因此在基因组中具有不同的RdRp的RdRp基因因此可以确保SARS-CoV-2和ZC45 / ZXC21分为不同的组 进化研究中的/亚系。然而，选择ChosinganRdRp基因是很方便的，因为已经记录了所有收集/检测到的冠状病毒的短RdRpsegments序列。 他们的最终选择是2013年发现的蝙蝠冠状病毒RaBtCoV / 4991的RdRp序列。对于RaBtCoV / 4991，唯一的信息是其短RdRpsegment83的序列，但从未报道其完整的基因组序列或病毒分离史。 在扩增RaBatCoV / 4991的RdRp片段（或完整的ORF1b基因）后，他们会使用它来随后组装和创建SARS-CoV-2基因组。

序列既可以在开始时引入（通过DNA合成），也可以稍后通过段落生成。 在另外一个轨道上，当他们从事RaTG13序列的构建时，他们可能以RaBtCoV / 4991的短RdRp片段开始，而没有引入任何序列改变，导致在这两个短RdRp片段上的两种病毒之间具有100％的核苷酸序列同一性。 然后可以声称该RaTG13病毒是在2013年发现的。

RaBatCoV / 4991的RdRp蛋白的独特之处在于，它在开发抗病毒药物方面优于任何其他β冠状病毒的RdRp。RdRphasnohomologsin人细胞使这种必需的病毒酶成为抗病毒开发的高度理想的靶标。 例如，目前正在接受临床试验的Remedesivir靶向RdRp。 当创建一种新型的，针对人类的病毒时，他们也将对开发解毒剂感兴趣。 即使这样的药物发现可能不容易实现，但对他们而言，有意掺入更适合抗病毒药物开发的RdRp是合理的。

第四，他们将利用反向遗传学将刺突，ORF1b和其余模板ZC45的基因片段组装成病毒基因组的cDNA版本。 然后，他们将进行体外转录以获得病毒RNA基因组。 将RNA基因组转染到细胞中可以回收具有所需人工基因组的活病毒和感染性病毒。

第五，它们将对病毒株进行特征化和优化，以提高其在体内的传播能力，感染力和适应性。然后，将获得满足某些标准的一种或多种病毒株作为最终产物。

假定的合成SARS-CoV-2合成路线

在本小节中，我们将更详细地描述如何使用可用的材料以及常规的分子，细胞和病毒学技术在实验室环境中执行每个步骤。 该过程的示意图如图8所示。我们估计整个过程大约需要6个月才能完成。

步骤1：设计Spike的RBM以进行hACE2绑定（1.5个月）

由于缺少初始RBM的重要残基，蝙蝠冠状病毒的穗状蛋白不能有效结合hACE2。这可以通过模板病毒ZC45的RBM进行例证（图4）。 创建SARS-CoV-2的第一步也是最关键的一步，就是对Spike进行工程改造，以使其具有对BindhACE2的能力。自2008年以来，在研究实验室就对这种证据进行了反复研究，成功地产生了具有感染人细胞能力的工程化冠状病毒44-46,88  ，89。 尽管可以用多种方法来改造Spike蛋白，但我们认为实际采取的措施是，它们以SARS的RBM为指导，用经过设计的，可能是经过优化的RBM代替了原来的RBM。 如第1部分所述，该理论得到了我们的支持，即在SARS-CoV-2基因组的RBM的两端都存在两个独特的限制性位点EcoRI和BstEII（图5A），并且通过这样的事实，史正利博士和她的长期成功完成了RBM交换 长期合作者和结构生物学专家FangLi博士39,47。

尽管ZC45尖峰不包含这两个限制位点（图5B），但可以很容易地引入它们。 原始的刺突基因可以通过RT-PCR扩增或通过DNA合成获得（可以将某些变化安全地引入序列的某些可变区），然后再进行PCR。然后，该基因将使用EcoRI和BstEII以外的其他限制酶克隆出隐窝质粒。

一旦进入质粒，就可以轻松修饰刺突基因。 首先，可以通过将突出显示的“ gaacac”序列（图5B）转换为所需的“ gaattc”（图5A）来引入EcoRI位点。 这两个连续核苷酸之间的差异。使用市售的QuikChange定点诱变试剂盒，这样的二核苷酸突变可以在一个多星期内生成。 随后，可以类似地在RBM的另一端引入BstEII站点。 具体而言，“ gaatacc”序列（图5B）将转换为所需的“ ggttacc”（图5A），这同样需要一周的时间。

一旦成功引入了这些限制位点（这些位点与SARS-CoV-2的穗状基因是唯一的），就可以方便地交换不同的RBM节段，随后使用确定的分析方法评估所得的穗状蛋白。

如第1部分所述，RBM段的设计可以由高分辨率结构（图3）37,38很好地指导，从而以智能的方式产生类似于SARS RBM的序列。 当进行RBM的结构指导设计时，他们会遵循常规并生成一些（例如十几个）这样的RBM，希望某些特定的变体可能比结合hACE2的其他变体更好。设计一旦完成，他们就可以在商业上拥有每个设计的RBM基因。 在5’端的EcoRI位点和3’端的BstEII位点合成（快速且负担得起）。 然后可以将这些新的RBM基因分别克隆到穗基因中。 基因合成和随后的克隆大约需要一个月的时间，而对于合成的RBM小型文库，可以分批方式完成。

然后，可以使用已建立的假型病毒感染测定法对这些工程化的Spike蛋白进行hACE2结合测试[45,49,50]。将选择具有良好的异常结合亲和力的工程化的Spike。  （尽管不是必需的，但这里可能涉及定向进化（对RBM基因的易错PCR），再加上体外结合试验39,90或假型病毒感染试验45,49,50，以获得与hACE2结合的RBM 具有非凡的亲和力。）

鉴于有关Spike工程44-46,84,86的大量文献以及Spike-hACE2复合物37,38的可用高分辨率结构，将非常有把握地保证这一步的成功。 到此步骤结束时，将获得期望的，能与hACE2高亲和力结合的sanovel Spike蛋白编码的anvelspike基因。

步骤2：在S1 / S2交汇处设计弗林蛋白酶切割位点（0.5个月）

来自步骤1的产物（一种含有工程刺突的质粒）将被进一步修饰，以在S1 / S2连接处包括弗林蛋白酶切割位点（图4中绿线指示的片段）。 可以使用几种常规克隆技术方便地插入这种短序列的基因序列，包括QuikChange定点PCR60，重叠PCR，然后进行限制性内切酶消化和连接91或Gibson组装。 这些技术都不会在序列中留下任何痕迹。 无论选择哪种克隆方法，插入的基因片段都将包含在引物中，引物将被设计，合成并用于克隆。 此步骤导致进一步修饰的Spike，在S1 / S2连接处添加了弗林蛋白酶切割位点，可在不超过两周的时间内完成。

步骤3：从RaBtCoV / 4991获取包含短RdR片段序列的ORF1b基因（1个月，但可以与步骤1和2同时进行）

与Spike的工程设计不同，这里不需要复杂的设计，只是需要包括RaBtCoV / 4991的RdRp基因片段。吉本装配法应采用这种技术。该方法将几个片段（每个相邻的对共享20-40 bp的重叠部分）结合在一起，以易于反应的方式组装在一起，沿着DNA产物组装在一起。 可以根据已知的蝙蝠冠状病毒序列选择ORF1b基因的部分。 这些片段之一将是RaBtCoV / 499183的RdR片段。应使用引物中引入的适当重叠区域对每个片段进行PCR扩增。 最后，将所有纯化的片段以等摩尔浓度合并，然后添加至吉布森反应混合物中，在短时间孵育后，将在整个过程中产生所需的ORF1b基因。

步骤4：使用反向遗传学产生设计的病毒基因组并回收活病毒（0.5个月）

逆向遗传常常要使用组装的整个病毒基因组，包括冠状病毒基因组67,92-96。 最近的一个例子是在东部97年利用转化辅助重组技术重建SARS-CoV-2基因组。瑞士小组利用这种方法在一周内就组装了整个病毒基因组并生产了活病毒.97。这种有效的技术将在创建的病毒基因组中不留任何人工操作痕迹，99,99。 除了工程化的刺突基因（来自步骤1和2）和ORF1b基因（来自步骤3），其他覆盖基因组其余部分的片段都可以通过模板病毒的RT-PCR扩增或DNA合成获得。 序列与模板病毒的序列略有不同。 我们认为，后一种方法更有可能，因为它允许将序列改变引入到保守性较低的可变区域中，该过程可以通过多个序列比对轻松地进行指导。更多保守功能的氨基酸序列，例如E蛋白，可以保持不变。 然后将所有DNA片段集中在一起并转化为酵母，然后通过转化辅助重组组装SARS-CoV-2基因组的cDNA版本。当然，也可以采用WIV在过去成功应用的另一种反向遗传学方法67。 从业人员67,92-96,100。 尽管一些较早的反向遗传学方法可能会在不同片段连接的地方产生更多的限制位点，但由于连接的确切位点可以在〜30kb基因组中的任何位置，因此很难检测到这些痕迹。 无论哪种方式，都可以从反向遗传学实验中获得病毒基因组的cDNA版本。 随后，以cDNA为模板的体外转录将产生病毒RNA基因组，转染到Vero E6细胞后将产生带有所有设计特性的活病毒。

步骤5：优化病毒的适应性并提高其与hACE2的体内结合亲和力（2.5-3个月）

从第4步中回收的病毒需要进一步进行经典实验-实验动物的连续传代101。 最后一步将验证病毒的适应性，并确保其针对预期宿主的面向受体的适应性，根据上述分析，宿主应为人。 重要的是，现在将分别引入穗蛋白的RBM和弗林蛋白酶切割位点作为一个功能单元一起进行优化。 在冠状病毒的各种可用动物模型（例如小鼠，仓鼠，雪貂和猴子）中，hACE2转基因小鼠（hACE2-小鼠）应该是此处最合适，最方便的选择。 这种动物模型是在SARS-CoV研究期间建立的，并已在Jackson实验室中使用了102-104年。

连续通过的过程很简单。 简而言之，将从步骤4中选择的病毒株，SARS-CoV-2的前体，经鼻内接种到一组麻醉的hACE2-小鼠中。 感染后约2-3天，肺部病毒通常会扩增至最高滴度。 老鼠会

然后处死，使肺匀浆。 通常，携带最高病毒载量的小鼠肺上清液将用于提取候选病毒用于下一轮传代。 经过大约10到15轮后，将充分增强hACE2的结合亲和力，感染效率和病毒株的致死性，并稳定病毒基因组。101。最后，经过一系列表征实验（例如病毒动力学测定，抗体反应测定，症状观察和病理学检查），最终产物，SARS-CoV  -2，将完成，包括整个创建过程。 从这一点开始，这种病毒病原体可以被扩增（最可能使用Vero E6细胞）并常规产生。

值得注意的是，基于在SARS-CoV上所做的工作，hACE2-小鼠虽然适合SARS-CoV-2适应，但并不是反映病毒在人体内的传播能力和相关临床症状的好模型。 我们相信那些科学家可能未在COVID-19爆发之前使用适当的动物模型（例如金色的叙利亚仓鼠）来测试SARS-CoV-2的可传播性。如果他们具有这种动物模型的实验具有高传染性，那么SARS-CoV-2的具有高度传染性的特性将非常明显，因此SARS-CoV 在疫情爆发之初，将2描述为“不引起人与人之间的传播”。

我们还推测，针对增强的传播能力和杀伤力而进行的广泛实验室适应，可能已将病毒推向了更高的高度。因此，SARS-CoV-2可能具有在其当前适应人类的过程中减弱传播能力和致死性的能力。 该假设与SARS-CoV-2的流行程度相差无几，迄今仍未见明显衰减，并且与最近出现的主要变异体仅显示出改善的透射性105-108的观察结果相符。

连续传代是一个快速而密集的过程，在此过程中，病毒的适应性得以加速。 尽管是预期的自然进化，但串行通道主义在时间和规模上都受到限制。 结果，与自然进化相比，连续传代中预期的随机突变更少。 对于保守的病毒蛋白，例如E蛋白，尤其如此。  E蛋白是病毒复制的关键因素，其毒性决定因素，其工程改造可能会使SARS-CoV-2减毒109-111。因此，在最初的组装阶段，这些科学家可能已经决定保留E蛋白的氨基酸序列。 与ZC45 / ZXC21相同。 由于E蛋白的保守性质和串行通道的限制，实际上没有发生氨基酸突变，导致SARS-CoV-2与ZC45 / ZXC21之间的E蛋白具有100％的序列同一性。 分子克隆的标记（RBM两侧的限制性酶切位点）也可能发生同样的情况。 连续传代应部分归化SARS-CoV-2基因组，可能无法消除所有迹象，因此只能进行人工操作。

结束语

关于SARS-CoV-2的起源，许多问题仍未得到解答。 著名的病毒学家在《自然医学》的信中暗示，虽然没有完全排除实验室逃逸的可能性，但SARS-CoV-2基因组4中没有出现任何基因操纵的迹象。但是，在这里，我们显示了SARS-CoV-2基因尖峰基因内的遗传证据（限制位点侧翼 （RBM；在插入的弗林蛋白酶切割位点使用的串联稀有密码子）确实存在，这表明SARS-CoV-2基因组应该是基因操作的产物。 此外，为了在短时间内方便地创建这种新型冠状病毒，已经采用了行之有效的概念，完善的技术以及知识和专长。

除了动机，关于SARS-CoV-2的以下事实得到了充分的支持：

如果它是具有代表性的产品，则最关键的要素是骨干/模板病毒（ZC45 / ZXC21），由军事研究实验室拥有。

SARS-CoV-2的基因组序列可能已进行了基因工程改造，通过该工程改造，该病毒已具有以高毒力和传染性靶向人类的能力。

SARS-CoV-2的特征和致病作用是前所未有的。该病毒具有高传播性，隐蔽性，多器官靶向性，后遗症不清楚，致死性，并伴有各种症状和并发症。

SARS-CoV-2引发了全球性大流行，夺去了数十万人的生命，并关闭了全球经济。 它具有像noother一样的破坏力。

从我们和其他人收集到的证据来看，我们认为找到SARS-CoV-2的起源应该涉及到独立的审计员对WIVP4实验室及其密切合作者的实验室进行。Suchan调查应该占据长处，不应进一步推迟。

我们还注意到，在2015年嵌合病毒SHC015-MA15的发布中，最初没有提及NIAID对郑立实的资助。 可能在2016年1月召开的会议上恢复了NIH对病毒功能获得研究的资助之后，该问题在2016年的出版物中更正了该错误。 这是不寻常的科学行为，需要解释。

在此报告中没有完全描述的各种证据表明，最近发表的几种冠状病毒（RaTG1318，RmYN0230和几种穿山甲冠状病毒27-29,31）是高度可疑的，可能是欺诈性的。 这些伪造除了欺骗科学界和公众之外，没有其他目的，从而隐藏了SARS-CoV-2的真实身份。 尽管排除此类证据的详细信息并不会改变本报告的结论，但我们确实相信这些详细信息将为我们认为SARS-CoV-2是一种功能增强研究的实验室增强型病毒和产品提供了额外的支持。 证据正在准备中，将很快提交。

致谢

我们想感谢Daoyu Zhang分享β冠状病毒不同亚类中E蛋白的突变发现。我们还要感谢匿名科学家和其他个人，他们为揭示与SARS-CoV-2起源有关的各种事实做出了贡献。

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Yount,B.etal.Reversegeneticsw

品葱用户 Shekzara 评论于 2020-09-15

科学角度上论证病毒来自实验室而非自然，进而能够坐实中共蓄意投毒罪行，将中共钉在绞刑架上

品葱用户 Xinyonghu 评论于 2020-09-14

诺贝尔和平奖实至名归。那几个替共匪背书的立普京以及柳叶刀主编一定会被作为甲级战犯受审
第三次世界大战正式落下帷幕，生物战争终于结束了。闫博士是真正的中华爱国者，也是地球这个大号索多玛城的圣人，因为闫博士人类又一次获得了被救赎的希望

品葱用户 **粵人館

Xinyonghu** 评论于 2020-09-15

>>诺贝尔和平奖实至名归。那几个替共匪背书的立普京以及柳叶刀主编一定会被作为甲级战犯受审第三次世界大战正…

顶你

品葱用户 郑欣迪 评论于 2020-09-14

还有砸闫博士的吗？混进来的五毛们，说他不靠谱。要证据？这就是证据！

品葱用户 **粵人館

郑欣迪** 评论于 2020-09-15

>>还有砸闫博士的吗？混进来的五毛们，说他不靠谱。要证据？这就是证据！

哈哈

品葱用户 Aloie 评论于 2020-09-14

就事论事，这里无论大家对郭家有什么分歧或看法，但从闫博士目前的所作所为，以及郭对其的支持，必须要挺！！冒着这么大的危险，能勇敢地站出来，是非常不容易的！！如果所述完全属实，说其是改变近代历史进程是毫不过分的。

品葱用户 **粵人館

Aloie** 评论于 2020-09-15

>>就事论事，这里无论大家对郭家有什么分歧或看法，但从闫博士目前的所作所为，以及郭对其的支持，必须要挺！…

是的，要是现在还攻击她简直就是五毛了吧

品葱用户 蔥港 评论于 2020-09-14

百國聯軍 指日可待

品葱用户 樋上至 评论于 2020-09-15

http://www.mediafire.com/file/2xsdcd4p1s99psp/20200914+The_Yan_Report.pdf/file
付一个推上找到的原文地址

品葱用户 **粵人館

蔥港** 评论于 2020-09-15

>>百國聯軍 指日可待

80国最好

品葱用户 **粵人館

樋上至** 评论于 2020-09-15

>>http://www.mediafire.com/file/2xsdcd4p1s99psp/2020…

谢谢

品葱用户 **Shekzara

郑欣迪** 评论于 2020-09-14

>>还有砸闫博士的吗？混进来的五毛们，说他不靠谱。要证据？这就是证据！

五毛看得懂这证据吗？

品葱用户 **郑欣迪

Shekzara** 评论于 2020-09-15

>>五毛看得懂这证据吗？

当没有科学报告时，五毛会要求上升到科学层面；
当科学报告出来后，五毛会迅速降级到道理和逻辑层面；
当政治、逻辑层面与科学层面都对五毛不利时，五毛就会跳脚骂娘撒泼打滚，把事情搞浑。

我相信葱油们都知道，谁是装的像反贼的五毛 谁是真心反共的人

品葱用户 fb_china_today 评论于 2020-09-15

哪位专家给总结一下？新加坡籍哪位mit研究员的结论就很好懂

病毒在人体表现了稳定性，在其他动物哪里则变异很快 说明病毒是专门适应人体（自然或特制）

https://pincong.rocks/article/23933
麻省理工学院分子生物科学家Alina Chan（新加坡裔）质疑病毒来自实验室

品葱用户 yuanshao 评论于 2020-09-15

有没有内行的葱油简单翻译一下呀😂

品葱用户 舞夜姬娓酒 评论于 2020-09-15

虽然没有专业知识，大概理解应该是说病毒自然形成可能性很低，并且文章给出了在实验室制造这种病毒的过程，需要6个月。
相信从今天开始海外会有针对此文的各种报道。要是有更多的相关领域专家能证明或者支持文章的观点，那就太好了。
因为不可能找到直接证据，论文提供的是间接证据，所以中共肯定是不会承认的，反正赔偿是要不到的。能和中国彻底脱钩已经是一个很好的结果了。

品葱用户 **Shekzara

舞夜姬娓酒** 评论于 2020-09-15

>>虽然没有专业知识，大概理解应该是说病毒自然形成可能性很低，并且文章给出了在实验室制造这种病毒的过程，…

我猜测中共国过几天会制造一个大新闻(军事层面)，比如中印边境或者台海捅篓子，或者唆使北韩核试验。其目的在于通过制造地区热点来转移国际社会对于病毒真相的追责，我相信中共一定会这样做的

品葱用户 BB8 评论于 2020-09-15

这是个draft，没有peer review之前不能下结论

品葱用户 byteinsight 评论于 2020-09-14

这是个报告而不是论文。具体的政策影响力有多大，需要看白宫对此的反应。我不是专业人士，我不好直接评价这个的分量(有可能被判定为重磅实锤，有可能被判定为没有比现在已知的信息提供更多的价值)，如果确实这个报道导致白宫做出剧烈反应，那么闫女士可是立大功了。如果没有，也不奇怪。

品葱用户 skunk 评论于 2020-09-14

這個和品蔥討論過的大體差不多吧，唯一亮點應該是提出了製作的方法和時間評估。只能算間接證據吧，不過這不重要重要的是美國和全世界政府準備怎麼辦。

品葱用户 IKARISHINJI 评论于 2020-09-15

过于专业，非相关人士建议别做判断

品葱用户 **billzt

BB8** 评论于 2020-09-15

>>这是个draft，没有peer review之前不能下结论

abstract里面写了，这个问题没有任何期刊杂志会接受peer review

其实就是土共在后面搞的鬼，谁敢接这个review土共就制裁谁

品葱用户 wuxingtu 评论于 2020-09-16

棒棒的，加油⛽

品葱用户 随机预言家 评论于 2020-09-16

希望在不远的将来能看到实锤证据

品葱用户 upgraded 评论于 2020-09-16

记得有人说闫博士只是养老鼠而已，这下可好！人家 report 都出来了，就坐等看有什么反驳的论证。

品葱用户 無紋水仙盆 评论于 2020-09-16

我看見有人說這是停留在蛋白質表現而已，沒有深入談論RNA
說到底其實沒什麼用處，但在政治上提供了一個戳中共屁股的理由這樣

繼蔡霞之後閻麗夢也要變郭文貴了嗎……連她都這樣，感覺普通中國人出逃的門越關越小了

品葱用户 zmla 评论于 2020-09-16

个人觉得我等非专业人士需要谨慎一点，还是等等专业人士圈子的反应比较稳妥

品葱用户 ESI 评论于 2020-09-15

**该用户被封禁，内容已自动替换**

中间派感到我们网站过于极端，对大陆人有仇恨，这个问题怎么解决？
答：

这些所谓的「理客中」们复读的「极端」与「只挺大雄太极端」没什么区别。如果胖虎欺凌的极端性是100，大雄反击的极端性是10，那么「2. 挺胖虎」的极端性是100，「1. 挺大雄」的极端性是10，「4. 两边都不对（实际上是两边都挺）」的极端性是55。谁更极端，也就一目了然不言自喻了。另说一句，岁月静好的「3. 装作无事发生」的极端性，按此说法，其实是0，如果他没有反对别人挺大雄。但如果他们反对别人挺大雄，那极端性则和2没有区别。因此，最不极端的做法就是什么都不说，其次是支持那些反抗更极端的人。

实际上，那些认为只挺大雄极端的人，本质上是不懂胖虎究竟对大雄做了什么的人。他们只看到大雄的反击就认为大雄这么做太极端了。他们没有看到胖虎三番五次对大雄的欺凌，也没有意识到各大五十大板会助长胖虎下一次的欺凌。你的朋友只看到了你葱「支来支去」的极端，却没看到你国（下指「中华人民共和国」）独裁政治，六四活摘集中营对整个人类文明的阻碍有多极端。「只反对胖虎不反对大雄就是极端」终究也只是因为有种「胖虎欺负我不到我头上」的幻觉罢了。

你的朋友也只是对你国存有幻想，没有意识到我们面对的敌人究竟有多极端。所以某种意义上来说，品葱正在做的「加速主义」其实是在帮助他们认识到你国的极端。等到他们利益受损，才会懂得什么是真正的极端。

品葱用户 HardcorePoet 评论于 2020-09-16

听了一下节目几个博士的解读，我觉得比较重要是1.3章节，闫博士找出了病毒中所有异常的furin酶切位点，这些是病毒编辑留下的痕迹，并且找出了中国哪些实验室用过这些酶切位点，并做出了病毒的整个施工流程图。

品葱用户 **郑欣迪

ESI** 评论于 2020-09-15

>>这玩意基本就是全篇瞎扯糊弄签证官混个政P，我能用类似的逻辑证明MERS也是人造的。里面最豹笑的就是那…

你来了？

品葱用户 **ESI

郑欣迪** 评论于 2020-09-15

**该用户被封禁，内容已自动替换**

两少一宽和所谓的少数民族优待
两少一宽是一种典型的法家策略，兼具了抹黑胡耀邦，劣化维族和激化民族矛盾三重功能。
两少一宽最早由胡耀邦提出，但那仅仅是严打的配套方案，仅仅是一个临时政策，本来在严打结束时就应该结束。而在严打结束时，连赵紫阳都垮台了，胡赵一脉的政治力量被连根拔起，没有不可能存在一个继承胡赵的政治力量继续执行这个政策几十年。
同时，在新疆的所谓少数民族优待是一种非常僵硬的优待，仅仅就只是规定每个企业必须雇佣一定比例的维族而已。实际情况就是因为大多数维族受教育程度低，单纯是作为一种企业成本被白养起来的。一方面汉人认为维族受到优待觉得嫉妒，另一方面，中共的驻疆兵团占据的大量新疆资源划归军用，而剩下的新疆企业在这种情况下自然也不会雇佣必须比例以上的维族人。同时，在新疆，很长一段的时间里，不允许被骗来的汉人迁出新疆，来了就不准走，但是少数民族可以随意迁离。通过这些政策逼迫新疆的维族人离开新疆谋生。
而两少一宽的本质是什么呢？？就是鼓励你去作奸犯科偷鸡摸狗不是么？？试想维族人受教育程度低，民风剽悍，被逼离开了新疆，还被赋予了偷鸡摸狗的私掠许可证，他们会做出诸如切糕小偷之类的行为不是完全顺理成章么？？这不完全是被政策鼓励出来的行为么？？一方面这个政策本身就劣化了维族，一方面这个政策挑拨了民族矛盾，另一方面，也顺利抹黑了胡耀邦。把胡耀邦说成胡乱邦明显是具有政治宣传色彩的。
就我看来这种政策是一种长期的法家策略，而缘由可能就源自89年，因为在89年的时候，维族和汉人站到了一起，特别是吾尔开希和李鹏的对线，给很多人留下了深刻印象，可能共匪也由此产生了心理阴影。

品葱用户 shepherd 评论于 2020-09-16

首先说个次要问题，主楼这个把学术文章机翻发出来，你觉得一片机翻文对于帮助普通群众准确理解这个文章有多大用处，我觉得误导占的比重更大。不如把zenodo的原文链接发出来。https://zenodo.org/record/4028830#.X2BWq5MzZb8
然后这个zenodo上的文别说peer-review了，这个连电影都能上传的网站你觉得作为科学论据的可靠性能有多大。

有人说闫在abstract里说没有杂志期刊敢接这个文，因为会被CCP制裁。真不懂这啥逻辑，CCP制裁全球性的学术杂志？或者你的意思是说CCP派黑客黑？那CCP怎么不黑了zenodo？而且这么一来怎么说都是你的了，以后科研工作者简历上写自己的publication list全写这种无审文章好了，问起来就说我研究的课题太敏感根本没有杂志敢来review我的文章。

我真心服了上面一群看到这个群魔狂舞说是“证据”的，Come the fuck on, 这连科学依据都不知道成不成立，离能上法庭当证据你们觉得还差多少。我感觉品葱第一次冲击之前风气不是这样的，现在怎么一群嘴里对五毛粉红不齿的身体很老实的干着五毛粉红的勾当的反五毛。

品葱用户 **仁波切尿袋王

shepherd** 评论于 2020-09-16

>>首先说个次要问题，主楼这个把学术文章机翻发出来，你觉得一片机翻文对于帮助普通群众准确理解这个文章有多…

脑残，你反驳的话语里也有一句跟科学有关？

品葱用户 **shepherd

仁波切尿袋王** 评论于 2020-09-15

>>脑残，你反驳的话语里也有一句跟科学有关？

你说的“跟科学有关”的是指什么？针对闫文章中的论点进行的反驳吗？那没有，因为你要的东西存在于peer-review当中，而你要的东西在概要中就被闫打预防针了“你要的东西没有的”。我反驳的话只是判断一个东西是否能成为科学论据乃至成为证据的基本常识而已。

你如果想反驳我的观点我洗耳恭听，如果存粹因为有人立场跟你不一样想开骂那请另开一个楼包你舒服，当然了得管理员同意

品葱用户 闽越国民 评论于 2020-09-16

快进到谭德塞上海牙

品葱用户 **BB8

billzt** 评论于 2020-09-16

>>abstract里面写了，这个问题没有任何期刊杂志会接受peer review其实就是土共在后面搞的…

那么多欧美杂志还能都怕包子。这种说法有浓烈的郭氏风格。

品葱用户 **仁波切尿袋王

shepherd** 评论于 2020-09-15

>>你说的“跟科学有关”的是指什么？针对闫文章中的论点进行的反驳吗？那没有，因为你要的东西存在于peer…

别在这造谣了

”你要的东西没有的“？？？

如果你看完文章还能得出这么弱智的结论，那你确实是个脑残

所谓”你要的东西“也就是论据都在她引用的文章里。

不要无谓地迷信peer-review好像它是神一样
https://twitter.com/Ayjchan/status/1305188512942227456
read this thread

闫博士发的报告不是为了所谓的做科研这么简单，而是要作为一个insider告诉世界和科学界真相

品葱用户 **Mrshithole

ESI** 评论于 2020-09-15

>>中间派感到我们网站过于极端，对大陆人有仇恨，这个问题怎么解决？答：这些所谓的「理客中」们复读的「极端…

去年反送中導致五眼主動接受大量技術性港人移民，寧的劣質謠言和人身攻擊暴露了自己

品葱用户 慶豐大帝習禁評 评论于 2020-09-15

作為分子生物學專業的碩士

這篇可以博士畢業加混到博士後研究員沒問題

生物學上的支持很充分了，剩下的就是政治問題

品葱用户 **AlanW

HardcorePoet** 评论于 2020-09-16

>>听了一下节目几个博士的解读，我觉得比较重要的一个点是——病毒编辑会留下酶切位点的痕迹，闫博士找出了这…

要是楼主能配上层主这张图就好了。

品葱用户 **Mrshithole

shepherd** 评论于 2020-09-15

>>你说的“跟科学有关”的是指什么？针对闫文章中的论点进行的反驳吗？那没有，因为你要的东西存在于peer…

所以寧快點指出文章哪一段哪一個論據是地攤貨？真正的天然冠狀病毒普遍特徵是什麼？你認為包病毒為天然的依據是什麼？ratg13序列沒有實物哪來的數據？
既然自稱專業更懂鄙視閆麗夢就有必要回答以上問題，不然按照人身攻擊處理

品葱用户 孟早舟 评论于 2020-09-16

下一步：实验室可重复性验证。

品葱用户 AlanW 评论于 2020-09-15

希望川普能尽快行动，虽然知道政治上的布置不是那么简单就能完成的，但还是希望能尽快。

品葱用户 **粵人館

ESI** 评论于 2020-09-15

>>中间派感到我们网站过于极端，对大陆人有仇恨，这个问题怎么解决？答：这些所谓的「理客中」们复读的「极端…

又到了我最喜欢的内容替换环节了

品葱用户 若名用户 评论于 2020-09-16

五毛果然来了，又是一模一样的套路，铁证如山无法反驳，就开始抹黑爆料者的名誉。
真是屡试不爽

品葱用户 习家包子 评论于 2020-09-16

不懂技术，咱也看不懂，就等着看看这个论文发出后国际上其他专家评价如何了。

品葱用户 担麦人吃包子 评论于 2020-09-15

我不想让自己的情绪波动到中共即将要完
有没有高手从专业的角度论证：这篇文章的含金量如何？

品葱用户 **shepherd

仁波切尿袋王** 评论于 2020-09-16

>>别在这造谣了”你要的东西没有的“？？？如果你看完文章还能得出这么弱智的结论，那你确实是个脑残所谓”你…

她的文章里引用谁的文章，引用之后如何运用于支持自己的观点，这都是她的论证方法啊，我说你要的东西需要经过至少是peer-review这样的方式来证明其论据到底经不经得起推敲，然后开头说很遗憾很难有。

当然没有神话peer-review，过审的文都还有很多审查者偏好之类的不定因素在这里面都还不能说一定有很高的含金量。但你不能换概念直接说不能迷信peer-review所以没有也无所谓对吧。好比作出的产品没测试过然后一帮人捧为神器，正常吗。

混这里的绝大部分希望有insider爆出真相吧，关键就是这东西和你口中的真相和证据差很远好吗，我的观点就是能不能在没有被更多的相关专业的验证之前别一口一个证据一口一个真相。

品葱用户 **shepherd

Mrshithole** 评论于 2020-09-16

>>所以寧快點指出文章哪一段哪一個論據是地攤貨？真正的天然冠狀病毒普遍特徵是什麼？你認為包病毒為天然的依…

大佬宁什么语序读我的文字读出人身攻击的？攻击的谁？上面的73双修哥对我一口一个脑残，一口一个弱智你不管管那个是不是人身攻击？还我那几行字说我比闫更专业更懂了？我不是相关专业的但是我的常识告诉我一群人捧刚出炉的一篇report为有科学依据的证据 这件事情非常二

品葱用户 **仁波切尿袋王

shepherd** 评论于 2020-09-16

>>她的文章里引用谁的文章，引用之后如何运用于支持自己的观点，这都是她的论证方法啊，我说你要的东西需要经…

好既然你硬要说peer-review, 那我明确可以告诉你，闫博士这篇报告出来之前是经过美国最牛的生化武器专家过目（也就是你所谓的peer-review）的，他对曹务春，李放，石正丽和Malik这帮搞病毒得熟得很，一看就明白其中得门道，可以说美国政府已经认可了这篇报告，你以为还想那些搞科研的投到某杂志审个半年？黄花菜都凉了，你也太naive了。

这篇报告论证了病毒是人造的，人造需要模板，模板是中共军方发现的且独有的，改造技术是中共研究多年的成熟技术，这叫差很远？

别睁眼说瞎话好吧

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